「すにっぷすいすい」の作り方(2)

次に、アレル特異的PCRによるSNPタイピング成功のポイントです。

アレル特異的PCRはシンプルな方法だけに、

注意すべきポイントがいくつかあります。

特異性がうまく出ない際には、多くの場合、

下記について検討することで解決します。

ポイント１）酵素は安いものを選ぶ

特異性が出ないケースでは、某大手メーカーの高機能Taqをお使いの場合が多いです。

高機能の酵素は、アレル特異的PCRには向きません。

安いポリメラーゼを使ってください。

（リーゾでは、AgilentのPaq5000をお勧めしています）

ポイント２）DNAのコンタミに細心の注意を払う

通常のPCRでは問題にならないレベルのコンタミで、特異性が消えてしまいます。

ポイント３）DNAを入れすぎない

できれば定量して、一定量を入れるのが理想ですが、

多数のサンプルをタイピングする場合にはそうも行かないでしょうから、

できるだけ同じ濃度で取れるように抽出系を工夫して、

少なめに加えるようにするのがコツです。

ポイント４）サイクル数を減らす

使用する機器が変わると（同じ機種でも）微妙に条件が変わることがあります。

酵素のロットによっても違ってくるので、症状を見て微調整します。

ポイント５）アニーリング温度を上げる

同上です。

上級レベルになりますが、うまく設計すれば、

ポジティブコントロール（必ず増えるバンド）を入れたり、

２箇所以上のSNPを同時にタイピングするマルチプレックスPCR系を組むことも可能です。

また、SYBR GreenIを混ぜてPCRし、リアルタイムPCR機でpostreadすることで、

電気泳動なしでタイピングすることもできます

（増幅が数値化されるので、エクセル等で半自動でタイピング結果を出せてすごく便利！です）。

いかがですか？

「アレル特異的PCR」を身近に感じていただけたでしょうか。

商売としては、「すにっぷすいすい」を頼んじゃうのがお勧めですよ！と言うべきところなのですが、

とりあえず自力でがんばってみるのもありです。

PCRに関るいろいろなことについて深く理解する必要があるので、

学生さんにとっては良い勉強にもなります。

問題は、うまく行かないときです。

対策の選択肢が多すぎて泥沼にはまり、

長期戦になった挙句にギブアップ、

というもったいない（人件費、消耗品費、時間、労力・・・）ケースも多いですから、

そういうときにはもちろん、リーゾにお任せくださいね！

Primer3のサイトはこちら
http://primer3.ut.ee/

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https://sg.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/

「すにっぷすいすい」のご案内はこちら
http://www.rizo.co.jp/SNPs-ici.html