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2011年1月31日 (月)

Dとれプロ⑮土壌と汚泥 その2

Dとれプロ⑮土壌と汚泥 その1 の続きです。

 

試作した「土壌・汚泥用」のDNA抽出バッファーで、DNAを抽出してみました。

土壌は、火山灰の多い人工水田の土(「水田土壌」)と、腐葉土の多い家庭菜園の土(「畑土壌」)、

活性汚泥は、「たれ・からし製造施設廃液処理用(A)」と、「給食製造施設廃液処理用(B)」、

の計4種類です(写真は、畑土壌と活性汚泥Bのものです)。

Photo 土の量はこのくらいです。

Photo_2 活性汚泥はこのくらいです。

プロトコルは、

1.バッファー900μlに、土壌100μl相当分を加え、

(または、バッファー500μlに、活性汚泥500μlを加え、)

ピペットチップの先でたたくようにしてよく混合する。

Photo_4 バッファーにサンプルを加えたところ。

Photo_3 よく叩き混ぜたところ。

2.遠心して上清700μlを別のチューブに移し、フェノクロ300μlを混合する

Photo_5 遠心しました。

Photo_6 移転した上清にフェノクロを加えたところ。

このあと上下に振って、よく混合します。

ここから先は、ほとんど見えないので写真省略です。

3.遠心して上清500μlを別のチューブに移し、イソプロパノール500μlを混合する

4.フリーザーで20分冷やしてから遠心

5.沈殿を70%エタノールでリンス

6.30μlの滅菌水に溶解

以上です。

 

研究者ならわかる、ステップ数の少なさ・・・。

所要時間は遠心、冷却も入れて1時間程度(実働時間20分程度)です。

土壌の場合、サンプルとフェノクロを同時に混ぜるのはどうかなと思い、

上清移転を1ステップ加えてみました。

活性汚泥なら同時処理でOKかもしれません。

 

こんなに簡単で、本当に取れているのでしょうか??

得られたDNAを10μl分、泳動してみました。

2

どれも取れてました!(一番上のバンドがゲノムDNA)

 

次に、DNAをそれぞれ250倍に希釈し、

バクテリア16SrRNA遺伝子用のプライマー(約720bpが増幅)を用いて

PCRをかけてみました。 

1

増えました!

この実験で、DNAが取れて、PCRがかかることが確認できました。

 

オールマイティーな抽出試薬を目指したつもりですが、

実際に全国の様々な土壌を入手するのは難しいため、

ここから先は、お客様にご自分の材料でご確認いただければと思っています。

土壌・環境関係の研究者の方、お試しになってみませんか?

  

info@rizo.co.jp

まで、ご連絡ください。試供品を、お送りします。

 

【謝辞】

活性汚泥は、中山環境エンジ株式会社様より、お分けいただきました。

中山環境エンジ様、貴重なサンプルを、ありがとうございました!

 

「美しい未来を残す」水質浄化のプロフェッショナル、

中山環境エンジ株式会社様のHPはこちらです。

http://www.nakayama-ee.co.jp/

 

 

  

 

 

 

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