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2010年6月の4件の投稿

2010年6月16日 (水)

Dとれプロ⑪黒米・赤米(有色素米)

DNAすいすいシリーズでこんなものからDNAがとれるかな?プロジェクト、

略して「Dとれ」プロ、第11弾「黒米・赤米」です。

Photo黒米です

Photo_2 赤米です

健康へ の機能性で注目される古代米の代表格の黒米と赤米。

最近、各方面で研究が進んでいるようです。

 

実はリーゾのお客様から、「DNAすいすい-Sでは、普通の米からはDNAがよく取れるが、

黒米、赤米は取れない。なんとかならないか?」とご相談を受けました。

 

有色素米の色素はアントシアニン、タンニンといったポリフェノール。

なので、「DNAすいすい-P」がお勧めです。

 

さっそく、黒米、赤米、コシヒカリ(玄米)各2粒から、DNAすいすい-Pで抽出してみました。

今回はDNAすいすい-Rも試しました。

(Rは粘性物質とポリフェノール、両方多いバラ科植物向けですので、これでも取れるはずです)

 

添加剤を含むバッファー400μlにつぶしたサンプル(各2粒)を加えて混合、

遠心して上清200μlをイソプロ沈で回収、という方法で行いました。

今回も、「フェノクロなし」です。

 

途中経過省略しますが、得られたDNAを鋳型として、

いつものプライマーでPCRをかけました。

その結果は・・・

Pcr

全て増幅。ちゃんとDNAが取れていることがわかりました。

(左はDNAすいすい-P、右はDNAすいすい-Rを使用して抽出したDNAです)

 

吸光度から計算した核酸量(RNA含む)ですが、

DNAすいすい-Pでは、

 赤米 約5μg(260/280比=1.80)

 黒米 約25μg(260/280比=1.86)

 コシヒカリ 約13.8μg(260/280比=1.86)

DNAすいすい-Rでは、

 赤米 約8.2μg(260/280比=1.84)

 黒米 約31.8μg(260/280比=1.86)

 コシヒカリ 約6.8μg(260/280比=1.87)

となりました。

 

ちなみにRを使う場合でも、Pのプロトコルと同じで大丈夫なので、

1抽出あたりのコストはどちらも約91円となります。

(注:通常のプロトコルでは、Rは1抽出あたり約190円のコストとなります) 

有色素米の場合のDNA収率は、Rの方がよいようです。

 

有色素米のご研究をされている方にも、DNAすいすいシリーズ、お勧めです!

【農研機構 作物研究所様、お買い上げありがとうございました】

 

DNAすいすい-P、DNAすいすい-Rのご案内はこちらです。

http://members3.jcom.home.ne.jp/rizo.inc/DNA-suisui-P.html

http://members3.jcom.home.ne.jp/rizo.inc/DNA-suisui-R-rose-bara.html

 

リーゾのHPはこちらです。

http://members3.jcom.home.ne.jp/rizo.inc/

  

2010年6月14日 (月)

Dとれプロ⑩ダイズ葉とメロン葉(フェノクロなし)

DNAすいすいシリーズでこんなものからDNAがとれるかな?プロジェクト、

略して「Dとれ」プロ、第10弾です。

「フェノクロなしに挑戦」第2回、今回はマメ科代表の「ダイズ」の葉、

ウリ科代表の「メロン」の葉でやってみます。

 

Photo

ダイズの葉です(枝豆についている葉、といえばわかりやすい?)。

Photo_2

メロンの葉です。

Photo_3

つぶす前の状態(左からダイズ11㎎、ダイズ3㎎、メロン40㎎、メロン10㎎)。

葉の面積はだいたい同じにしたつもりなのですが、ダイズの葉は軽いようです。

 

バッファーは「DNAすいすい-P」、添加剤入りで400μlです。

Photo_4

「ディスポのペッスル」でつぶした後です。

ちなみにディスポのペッスルとは、

Photo_5

これです。

ブルーチップの先をライターの火であぶって丸めたものです。

(真似する際は、引火物を遠ざけ、やけどに気をつけて自己責任で作ってください)

 

フェノクロなしで遠心し、上清300μlをイソプロ沈。

白い沈殿が得られました。

ダイズは50μl、メロンは100μlの水に溶解(溶け残りはやはり出ました)。

 

10倍希釈液1μlを鋳型としてPCR。

Pcr

増えました!

データは出してませんが、原液1μlを鋳型とした場合も増幅しました。

 

吸光値から計算した核酸量(RNA含む)は

ダイズ11㎎:5μg

ダイズ3㎎:2μg

メロン40㎎:15.5μg

メロン10㎎:4.5μg

で、260/280比は1.75~1.9となりました。

 

マメ科植物はタンパク質が多いので、フェノクロなしは無理かもと思いましたが、

葉なら特に問題ないようです。

 

というわけで、マメ科、ウリ科の育種関係者の皆様にも、

「DNAすいすい-P」、お勧めです!

【農研機構・野菜茶業研究所様、お買い上げありがとうございます。】

 

リーゾのHPはこちらです。

http://members3.jcom.home.ne.jp/rizo.inc/

  

 

2010年6月 8日 (火)

Dとれプロ⑨金魚からのDNA抽出

DNAすいすいシリーズでこんなものからDNAが取れるかな?プロジェクト、

略して「Dとれ」プロ第9弾、「金魚」です。

 

ずっと前からさんちゃんに協力してもらうつもりでしたが、

このたび本人の快諾が得られましたので(*)、ついに挑戦します。

(*:推定です。)

Photo

まずは体表粘液。綿棒でそっとこすります。

魚体を痛めずにすむので、これでDNAが取れれば一番です。

Photo_3

 

体表粘液だけでは不安なので、ハラビレもちょっとだけもらいました。

Photo_2

ほんとうにほんのちょっと、湿重で1㎎程度です。

ちなみにハラビレをカットしても血はでませんし、

もちろん再生しますのでご安心を・・・。

 

さんちゃんには水槽にお帰りいただいて、DNA抽出に進みます。

バッファーは、「これでいけるのでは?」という組成で2種類、調製してみました。

それぞれ、「綿棒(粘液)」「ヒレ」の入ったチューブに400μl注ぎ、

60℃で15分保温します。

Photo_4

保温後のヒレはこんな感じです。

綿棒の方は、見た目は変わりません。

 

タンパク質の除去のため、フェノール・クロロホルムを150μl加えて混合し、

遠心します(綿棒は入ったままで行いました)。

 

上清200μlをイソプロ沈してリンス。

沈殿を50μlの滅菌水に溶解しました。

ここでPCRですが、金魚なので、金魚(淡水魚全般)の18SリボゾーマルRNA遺伝子上に

設計・合成した特製プライマーを使いました。

 

その結果・・・

 

Pcr

増えました!

 

特に体表粘液の方は、100倍希釈して1μlでも十分なので、

PCR5000回分以上取れていることになります。

体表なので、バクテリアなどのDNAも共存しているはずですが、

とりあえず淡水魚のDNAが大部分を占めていると推定できます。

  

抽出されたDNA量を吸光値より計算したところ、

・体表粘液は8~10μg

・ヒレは3~8μg

のDNAが得られていることがわかりました。

ゲノムの電気泳動でも、かなり分子量の大きいDNAが取れていることが確認できました。

 

魚類の体表粘液・組織からの簡便なDNA抽出バッファーとして、

商品化準備中です。

⇒商品化しました!

「DNAすいすい-F」のご案内はこちらです。

http://members3.jcom.home.ne.jp/rizo.inc/DNA-suisui-F.html 

 

体表粘膜に寄生・感染した病原菌の同定などにも使えそうですので、

そちらの方も別途、検討する予定です。

 

【蛇足】

「オフィスで孵化した稚魚の親は誰?」その後の情報ですが、

1.しっぽがミューズより大きくひらひらしている

2.しっぽが黒い(ものがいる)

というわけで、おそらく母親はさんちゃんと思われます。

9匹に減りましたが、すでに「金魚」といえる体型に成長しました。

今後が楽しみです!

  

リーゾのHPはこちらです。

http://members3.jcom.home.ne.jp/rizo.inc/

  

  

 

 

 

 

 

2010年6月 2日 (水)

Dとれプロ⑧フェノクロなしに挑戦

DNAすいすいシリーズでこんなものからDNAが取れるかな?プロジェクト、

略して「Dとれ」プロ、第8弾です。

 

最近、お客様から「なるべくフェノクロ処理は避けたい」という

ご要望が多く寄せられています。

DNA抽出の実際の作業は、非常勤の実験補助の方に依頼するケースが多く、

有害な有機溶媒の使用はお願いしにくい、という事情があるようです。

 

DNAすいすいシリーズでは、きれいなDNAを得るために、

基本的にはフェノクロ処理による除タンパクのステップを入れることをお勧めしていますが、

得られるDNAに求めるグレードによっては、フェノクロ処理が要らない場合もあります。

「PCRレベルのDNAが取れればいい(できれば簡単に・・・)」

という場合向けに、フェノクロなしでどうなるかをいろいろな材料で

検討してみたいと思います。

 

手始めに、お問い合わせの多い「ナス科植物の葉」をためしてみました。

材料は、ナスの葉(左)と、ジャガイモの葉(右)です。

Photo

それぞれ約40mg、約10mgをカットしてチューブに入れ、

DNAすいすい-P(バッファー360μl+添加剤40μl)を加え、

Photo_2

「ディスポのペッスル」でつぶしました。

Photo_3

本来ならここでフェノクロですが、加えずにそのまま遠心。
上清300μlを回収して等量のイソプロを加え、再度遠心。

かなり大きなペレットが出現しました。

Photo_4

100μlの水を加えて溶解しましたが、不溶の部分が若干残りました。

(取り除けなかったタンパク質と推定されます)

 

でもDNAは溶けているはずなので、不溶の部分は遠心で固め、

上澄みを取って濃度を測定。
 
ナス(40mg):280ng/μl

ナス(10mg):102ng/μl

ジャガイモ(40mg):250ng/μl

ジャガイモ(10mg):150ng/μl

 

電気泳動してみたところ、RNAがかなり混ざっており(画像省略)、

DNAは半分程度と見た方がよさそうです。

 

いつものプライマーでPCRをかけてみました。

1

10分の1希釈して1μlを鋳型とした場合もちゃんと増幅しました。

ということは、PCR1000回分取れていることになりますね・・・。

 

次に「ミニトマト」でやってみました。

ちょうど花も咲き、小さな実もあったので、

「葉」「ガク」「未熟果実」「花」で試しました。

サンプル量はそれぞれ約30㎎(ガクは60㎎)です。

Photo_5

Photo_6

こちらも全てDNAが取れ、PCRがかかりました。

2

というわけで、「DNAすいすい-P」でナス科の野菜の葉(など)から、

フェノクロなしでDNAが取れることがわかりました。

生の植物体なら、出発材料は~10㎎程度でじゅうぶん、

粉砕も「軽く」でOK、なようです。

 

・・・なにより、フェノクロなしは楽だし安全、確かにいいですね。

ラボのために日々がんばってくださるパートさんの健康のためにも、

「DNAすいすい」お勧めです!

  

今回使用しました、「DNAすいすい-P」のご案内はこちらです。

http://members3.jcom.home.ne.jp/rizo.inc/DNA-suisui-P.html

 

ほかにもいろいろ、「農」の研究の、お役立ちアイテムがありますよ。

リーゾのHPはこちらです。

http://members3.jcom.home.ne.jp/rizo.inc/

 

  
  
  
 

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